荧光素酶报告基因的检测原理

荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。

自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。
发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催化D2荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。

这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。

荧光素酶报告基因的检测流程

1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc的重组质粒；

2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞或原代细胞等；

3、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h；

4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激；

5、细胞处理: 采用进口Promega双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；

6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。

荧光素酶报告基因的优点

1、优越的灵敏度，比Westernbloting灵敏度高1000倍以上；

2、内源性低，哺乳动物无内源性表达；

3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响；

4、发光检测，检测方便；

5、灵敏度高，10‐20摩尔荧光素酶分子；

6、检测范围广，大于7个数量级。

双荧光素酶检测结果示例

主要应用领域

1、潜在启动子/启动子核心区域检测；

2、潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测；

3、启动子区可能的转录因子结合位点检测；

4、启动子/增强子与转录因子的相互作用；

5、病毒/细胞相互作用；

6、药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）；

7、射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）。

荧光素酶报告基因检测方法与Western-Blot检测方法在

细胞信号转导通路调控机制研究中的区别

1、荧光素酶报告基因检测是测定上游刺激对下游靶基因在转录水平的影响，即对靶基因mRNA表达水平的影响，可以通过实时荧光定量PCR来验证；Western blot是测定上游刺激对下游靶基因对应的蛋白表达水平的影响，特别是磷酸化程度的改变。因此，两方面的实验结果可以结合起来更细致、更全面地揭示细胞信号转导调控的分子机制。

2、荧光素酶报告基因检测方法操作过程相对简单，检测灵敏度较高；Western blotting操作过程繁琐，检测灵敏度较低。

3、荧光素酶报告基因检测只需要成功将含有目标DNA序列插入到报告载体中，即可进行后续实验，Western blotting则需要购买商品化的一抗，一般价高量少，且抗体的杂交条件需要摸索；若自制的一抗，抗体效价需要验证，实验周期较长。

   双荧光素酶报告基因检测服务

依科生物报告基因检测实验系统采用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统。

服务简介

沈阳依科生物报告基因检测实验系统采用萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)和海肾荧光素酶(Rellina Luciferase)组成双荧光素酶报告基因实验系统（Dual-Luciferase Reporter Assay）。实验中萤火虫荧光素酶与基因表达的特定实验条件相关，海肾荧光素酶用来做转染的内参，以校正不同样品之间转染的转染效率。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶不需要翻译后修饰即具有生物活性，一旦翻译完成即具有报告基因的功能。通过加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应过程中会发出生物荧光，然后可以通过荧光测定仪测定反应过程中释放的生物荧光。

                pGL3-Basic载体示意图   

            pRL-TK载体载体示意图

不同长度启动子载体构建

通过这种方法,，有可能把可能削弱实验准确性的内在因素的变化降到最小，这些内在因素包括：培养细胞的数目和健康状况的差别，细胞转染和裂解效率的差别等。

依科生物双荧光素酶报告基因检测服务

1、序列分析。
2、相关载体亚克隆。
3、细胞培养及报告基因质粒、转录因子的共转染。
4、荧光素酶活性检测。
5、实验报告。

客户提交样本要求

客户可以提供构建好的含目的调控元件的报告基因质粒，并提供报告基因质粒的全部相关信息。也可以提供目的调控元件序列及相关信息，由依科生物将其克隆到相应的报告基因质粒上。

依科生物的优势

1、拥有长期的报告基因实验分析经验，帮助你合理设计实验。
2、高效转染试剂、高灵敏度荧光素酶检测试剂盒，确保结果的可靠性。
3、全面的技术服务，提供详细的原始数据和实验报告。

交付结果

完整的实验报告，包括实验数据，图片，结果分析等。